X線結晶解析> CrystalClear1.3> データ処理

回折データの処理

　回折データの処理は“ClystalClear ver.1.3.6 SP3”でも可能です。

8. “Integrate Reflections”

　収集した回折データから、積分反射強度を見積もる。
　＊タンパク質結晶の場合、Mask Fileを作成する必要は特に無い。

“Main”タブ

“Advanced”タブ

以上、確認の上、「Run」。
　⇒　｢You are not using a mask file. ・・・｣との確認画面が表示。
マスクファイルを使用しない場合、｢はい（Ｙ）｣。
＊通常、タンパク質の解析ではマスクファイルは使用しなくとも問題無い。
　⇒　処理開始。

参考：Ice Ringについて

　回折画像の3.5Å付近に水（氷）の回折に依存したリングが生じることがある。
　｢Ice Ring｣の実行で、水のリングを取り除けるが、同時にその周辺の回折斑点も除去されてしまう。 結果、最終的な構造解析に問題が生じる可能性があるため、｢Ice Ring｣の実行は余程のことがない限り、避けるほうが無難。
　タンパク質由来の回折X線が十分検出できれば、大きな問題にはならない。 また、仮にリングが原因で回折斑点が棄却されたとしても、他のイメージで等価な反射が確認されることは十分ありうる。

　最も重要な点は、強い水のリングが生じる原因（大きな霜の付着等）を取り除くこと （吹付低温装置｢参考：霜付きについて｣参照）。
　霜付きがないにも関わらず強いリングが生じる場合は、抗凍結剤があっていない可能性があるので、その組成を見直す。

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9. “Analyze Data”

　ラウエ対称から、空間群の決定を行う。
　Flow bar の Analysis Data をクリックすると以下のサブパネルが開く。

9.1 “Laue”

　ラウエ対称を決定。

以上、確認の上、「Run」。
　⇒ Laue Resultに解析結果が表示される。
PASSされた解のうち一番対称性が高いもの（回答の一番下）を選択し、「OK」。

9.2 “Centricity”

以上、確認の上、「Run」。
　⇒ Centricity Resultが表示される。
acentricを選択し、「OK」。

9.3 “Spacegroup”

　空間群を決定する。

以上、確認の上、「Run」。
　⇒　Spacegroup ResultsのSpacegroup Foundに推測される空間群が示される。
　　　下記「Spacegroup Foundについて」参照
結果を確認し「OK」。

参考：Spacegroup Foundについて

　Spacegroup Foundに一つの空間群が示されれば問題無いが、複数の回答が示される場合がある。

らせん軸の消滅則から判断できない場合
　空間群の種類によっては同じ消滅則を持つものがあり、その場合空間群を特定することは出来ない（例えば、P31･･･とP32･･･、P41･･･とP43･･･）。
　この場合は、両方の空間群で、別個に次のScale and Averageを行い、強度ファイルを作成し、 それぞれ空間群で構造解析を進める必要がある（正しい空間群は構造解析を通して決定する）。

回折データの量が十分で無い場合
　十分な角度領域の回折画像を収集できていない場合、空間群を決定することは出来ない。
　これを防ぐには、180°分の角度領域を測定し解析する。

　“CrystalClear ver.1.3.6 SP3”では“Space Group Results”として表示される。
　｢参考：“Space Group Results”｣も併せて確認のこと。

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10. “Scale and Average”

　構造解析に用いる強度ファイルを出力。

“Main”タブ
 “Advanced”タブ

以上確認の上、「Run」。
　⇒　解析開始。
解析終了後、結果を示したファイルdtscaleaverage.logが表示される。
反射ファイル（ScalAveraged.ref＝構造解析に用いるデータ）は、作業フォルダ内に保存されている。

　必要に応じてScale and Averageは繰り返し実行する（｢参考：Spacegroup Foundについて｣・｢ここまでの注意点及び改善点4｣参照）。

以上で、回折データの処理が終了。

ここまでの注意点及び改善点4

　dtscaleaverage.logで以下の点を確認する。

R-merge（「Rmerge vs. Resolution」のRmerge shell）
 　累積の値を確認し、0.05（＝5％）以下の値なら良質のデータ、0.1（＝10％）以下なら問題なく解析を行える。
　0.2（＝20％）以上の値をとるデータの信憑性は薄い。
　また、高角の測定領域の値も確認し、値が悪ければ（0.3以上）その測定領域を除く（｢Resolution（Å）｣を設定し直す）。

Completeness（「Completeness vs. Resolution」のCompleteness shell）
 　R-merge同様、累積値、高角領域の値に着目。
　80％以上であれば十分な精度を持った構造解析が行える。値が悪い場合は、高角領域を切る等の処理が必要。

　上の作業で分解能を下げていくことになるが、条件を満たした分解能が、実際の反射データの分解能となる。
　タンパク質の構造解析には最低でも3Å以上の分解能が必要とされている（分子量にもよるが2Å分解能以上が普通）。

Rdued ChiSq（「Rmerge vs. Resolution」のRdued ChiSq）
 　Rdued ChiSqの値を確認し、必要に応じてRdued ChiSq が1.0に近づく様に補正（Scale and Averageを再実行）する。
・0.90＜Rdued ChiSq＜1.90の場合
　1.0であるに越したことは無いが、特に補正の必要は無い。
・Rdued ChiSq＜0.90の場合
　Error Model：　Weigth Multiplier → Explicitを選択。1.0〜2.5の範囲の値を入力。
　Error Model：　Weight Added → Auto-Rmergeを選択。
・1.90＜Rdued ChiSqの場合
　Error Model：　Weigth Multiplier → Explicitを選択。2.5〜4.0の範囲の値を入力。
　Error Model：　Weight Added → Auto-Rmergeを選択。

　以上を確認後、再びScale and Averageを実行する（必要なら何度か繰り返す）。

（注）
　補正を行ってもRdued ChiSqの値が改善されない場合、データ（結晶）の質が良くないか、結晶系や格子等が間違っている可能性がある。
（注）
　Scale and Averageを繰り返す度に、ScalAveraged.ref、dtscaleaverage.logが作製される。
　ファイル名に番号が付いていないものが、最終的な処理したファイル、つまり構造解析に用いるファイルとなる。

　複数の空間群が解として得られている場合、最終的な空間群の決定は実際に構造解析を行って判断する。

　CrystalClearの操作、すなわち回折実験を通して最も大切なことは、質の良い結晶で十分な量（180°分以上）の回折画像を撮影することである。

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11. “CrystalClear”終了

メニューバー　File → Exit。
　⇒　確認画面が表示。
「はい（Y）」
　⇒　“CrystalClear”画面が閉じ、終了。

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